Proovide ettevalmistamine:
Proovide kogumine: koguge selliseid proove nagu veri, kude, sülg ja uriin vastavalt katse eesmärgile.
DNA ekstraheerimine: DNA ekstraheerimiseks proovist kasutage spetsiaalset DNA ekstraheerimise komplekti.
PCR reaktsiooni ettevalmistamine:
Projekteerimismerud: disainipõhised praimeripaarid, mis põhinevad malli DNA amplifitseerimise sihtjärjestusel.
Valmistage reaktsioonisegu: sealhulgas matriitsi DNA, praimerid, puhver, DNA polümeraas, DNTPS (desoksünukleosiid trifosfaadid), Mg 2+ jne.
Määra PCR -programm:
PCR -instrumendi sätted: sisestage eelseatud PCR -tsükli parameetrid, näiteks 95 -kraadine temperatuur, denatureerimistemperatuur (näiteks 95 kraadi), lõõmutamistemperatuur (näiteks 55 kraadi), pikendustemperatuur (nagu 72 kraadi) ja tsüklite arv.
PCR reaktsioon:
Lisage proov: lisage reaktsioonisegu PCR reaktsioonipaaki või kiibile ja igal proovil on tavaliselt üks reaktsioonikaev.
Tehke PCR: PCR -instrumenditsüklid vastavalt eelseadistatud programmile, sealhulgas küte, jahutamine, lõõmutamine ja pikendusetapid.
Tooteanalüüs:
Jahutamine pärast amplifikatsiooni: pärast PCR -i lõpuleviimist jahutatakse proovi lühidalt 4 kraadi juures.
Elektroforeetiline eraldamine: kasutage erineva pikkusega PCR -produktide eraldamiseks geelelektroforeesi tehnoloogiat, näiteks agaroosgeeli elektroforeesi.
Fluorestsentsi skaneerimine: fluorestsentselt märgistatud praimerid kiirgavad amplifitseeritud toote konkreetset lainepikkust valgust ja PCR -instrument loeb neid signaale ja registreerib need.
Andmetöötlus ja tõlgendamine:
Andmeanalüüsi tarkvara: kasutage spetsialiseeritud tarkvara fluorestsentssignaali analüüsimiseks ja sihtfragmendi kontsentratsiooni või suhtelise kontsentratsiooni arvutamiseks.
Tulemuste tõlgendamine: PCR kõvera ja algtaseme põhjal määrake, kas PCR on edukas, kas sihtfragment on olemas ja kui palju see on.
Tulemuste salvestamine ja säilitamine:
Salvestage tulemused eksperimentaalses aruandes ja säilitage algsed andmed ja proovid õigesti.